Sa molecular biology, ang mahusay na pagpipilian ng buffer at paghahanda para sa iba't ibang mga hakbang sa paghihiwalay ng DNA ay maaaring ang pagkakaiba sa pagitan ng paglipat sa protina expression o pagbubukas ng isa pang maxi-prep kit upang magsimulang muli. Sa kabila ng kanilang napakahalagang kahalagahan, ang mga recipe ng buffer ay kadalasan lamang na mga resipi na isinulat nang walang paliwanag o makatwirang paliwanag para sa iba't ibang mga sangkap. Ang isang ganoong buffer ay glucose-tris-EDTA o GTE buffer.
$config[code] not foundAno ang GTE Ginamit Para sa?
Ginagamit ang GTE upang muling ibalik ang bacterial cell pellets bago ang lysing (breaking bukas) ang mga cell at pag-aani ng plasmid DNA sa loob. Ang Lysozyme, na nagpapalambot sa mga lamad ng cell, ay kadalasang idinagdag kasama ng GTE buffer. Pagkamit ng isang homogenous suspension ng buong mga cell sa panahon ng hakbang na ito upang ang mga kasunod na idinagdag lysis solusyon ay maaaring makuha sa lahat ng mga cell ay susi sa pagkuha ng magandang mga magbubunga ng DNA. GTE ay dinisenyo upang gawin ito habang nagbibigay din ng isang matatag na kapaligiran para sa DNA.
Asukal para sa Osmolarity
Ang 50mM (millimolar) asukal sa glucose ay idinagdag sa GTE buffer upang mapanatili ang osmolarity kung saan ang solute concentration sa labas ng mga cell ay malapit sa loob ng mga cell. Pinipigilan nito ang napaaga na cell lysis, na maaaring maging sanhi ng mas mababang mga panukalang DNA dahil sa pagsasama-sama at pagkasira. Ang iba pang mga sangkap ng buffer ay nakakatulong din sa osmolarity ng solusyon, ngunit ang glucose, pagiging isang non-electrolyte, ay isang mahusay na pagpipilian dahil hindi ito makagambala sa mga katangian ng buffer ng solusyon.
Tris para sa pH Katatagan
Ang Tris ay ang maikling pangalan para sa tris (hydroxymethyl) aminomethane, na isang pangkaraniwang pH buffer. Sa kaso ng GTE buffer, ang acid salt (Tris-HCl) ay idinagdag sa buffer sa isang konsentrasyon ng 25mM. Ito ay nagpapanatili ng pH ng solusyon sa isang malapit-physiological 8.0, isang perpektong pH para sa pagpigil sa acid hydrolysis (marawal na kalagayan) ng plasmid DNA at hindi kanais-nais na mga reaksiyong side ng iba pang mga sangkap ng cell.
Pinipigilan ng EDTA ang Degradation ng DNA
EDTA, o ethylenediaminetetraacetic acid, kumukuha o "chelates" na metal ions mula sa solusyon, na pumipigil sa kanila na makilahok sa mga hindi gustong reaksiyon sa tabi. Sa GTE buffer, EDTA ay idinagdag sa 10mM. Ang pangunahing layunin nito ay ang buffer upang mag-ikot ng libreng zinc, magnesium, at kaltsyum, sa gayon ay maiiwasan ang pagkasira ng DNA sa ilang mga landas na nangangailangan ng mga riles.
Ang ilang Mahalagang Tip
Panatilihing malamig ang iyong GTE buffer at gawin ito sa mga maliliit na dami upang pigilan ang paglago ng mga hindi nilalayong bakterya sa loob nito. Ang asukal at ang kinokontrol na pH ay gumagawa para sa isang mahusay na daluyan ng paglago. Laging gumamit ng purified water. Ang pag-tap ng tubig ay maaaring magkaroon ng labis na mga ions ng metal mula sa mga tubo, na maaaring mapalawak ang kakayahan ng EDTA upang makuha. Kung pinaghihinalaan mo ang pagkakaroon ng nakakasagabal na RNA sa iyong sample, idagdag ang RNase A sa 100 micrograms bawat milliliter sa iyong GTE buffer upang maalis ang problema.
